Jiné přenosové (blotovací) technologie, jako je Western blot, Northern blot, Southern blotting, používají podobné metody, ale pro detekci RNA nebo proteinu ve vzorku, a jsou pojmenovány podle metody vynalezené Southernem. Vzhledem k tomu, že Southern blot je pojmenován po vědci, termín je psán velkým písmenem, zatímco Western blot a Northern blot jsou psány malým písmenem.
Metoda
- Restrikční endonukleázy štěpí vysokomolekulární DNA na menší fragmenty.
- Fragmenty DNA jsou podrobeny elektroforéze na agarózovém gelu pro separaci délky.
- V případě, že některé fragmenty DNA jsou delší než 15 kb, je gel před přenosem ošetřen např. kyselinou chlorovodíkovou, která způsobí depurinaci DNA a usnadní přenos na membránu.
- Při použití metody alkalického přenosu se agarózový gel umístí do alkalického roztoku, který denaturuje dvoušroubovici DNA a usnadní vazbu negativně nabité DNA na kladně nabitou membránu pro další hybridizaci. V tomto případě je zničena i zbývající RNA.
- Na horní nebo spodní stranu agarózového gelu se umístí vrstva nitrocelulózové (nebo nylonové) membrány. Tlak je aplikován přímo na gel nebo přes několik vrstev papíru. Pro úspěšný přenos je nutný těsný kontakt mezi gelem a membránou. Tlumič je transportován kapilárními silami z oblasti s vysokým obsahem vody do oblasti s nízkým obsahem vody (membrána). To zahrnuje přenos DNA z gelu na membránu. Polyaniontová DNA se váže na kladně nabitou membránu prostřednictvím iontoměničových interakcí.
- Pro konečnou fixaci DNA na membránu se tato zahřeje ve vakuu na teplotu 80 °C po dobu dvou hodin nebo se osvětlí ultrafialovým zářením (v případě nylonových membrán).
- Hybridizace radioaktivně (fluorescenčně) značeného vzorku se známou sekvencí DNA se provádí pomocí membrány.
- Po hybridizaci se přebytečný vzorek z membrány smyje a produkty hybridizace se vizualizují autoradiografií (v případě radioaktivního vzorku) nebo se posoudí barva membrány (v případě chromogenního barvení).
Výsledek
Hybridizace vzorku se specifickou oblastí DNA fixovanou k membráně indikuje přítomnost analyzované nukleotidové sekvence ve vzorku.
aplikace
Ke stanovení lze použít Southern blotting, který se provádí s genomovou DNA ošetřenou restrikčními endonukleázami čísla kopií genů v genomu. Sonda, která hybridizuje pouze s jediným fragmentem DNA, který nebyl štěpen restrikčními enzymy, bude produkovat jeden pruh na Southern blotu, zatímco více pruhů na blotu ukazuje, že sonda hybridizovala s více identickými sekvencemi. Změny hybridizačních podmínek (zvýšení teploty, při které se hybridizace provádí, změna koncentrace soli) vedou ke zvýšení specificity a snížení hybridizace s blízkými, ale ne identickými sekvencemi.
Napište recenzi na článek "Southern blot"
Poznámky
viz také
| Alfa šroubovice | Toto je návrh článku o biochemii. Projektu můžete pomoci jeho přidáním. |
Úryvek charakterizující Southern blot
– Nesmrtelnost, drahá... Jen nesmrtelnost. Ale bohužel nechápe, že se to nedává jen proto, že to někdo chce. Dává se, když člověk za to stojí, když VÍ, co není dáno druhým, a využívá to ve prospěch jiných, hodných lidí... Když se Země stane lepší, protože na ní tento člověk žije.- Proč to potřebuje, mami? Vždyť nesmrtelnost je, když člověk musí žít velmi dlouho? A to je velmi těžké, že? Dokonce i pro mé vlastní krátký život každý dělá mnoho chyb, které se pak snaží odčinit nebo napravit, ale nemůže... Proč si myslí, že by mu mělo být dovoleno udělat jich ještě víc?..
Anna mě šokovala!... Kdy se moje malá dcera naučila myslet úplně jako dospělá?... Pravda, život s ní nebyl příliš milosrdný ani měkký, ale přesto Anna velmi rychle vyrostla, což mě potěšilo a znepokojilo. zároveň ... byl jsem rád, že každým dnem sílila a zároveň jsem se bál, že se velmi brzy stane příliš samostatnou a nezávislou. A bude pro mě velmi těžké, v případě potřeby, ji o něčem přesvědčit. Vždy brala své „odpovědnosti“ mudrce velmi vážně, milovala život a lidi celým svým srdcem a byla velmi hrdá, že jim jednoho dne může pomoci stát se šťastnějšími a jejich duše čistší a krásnější.
A nyní se Anna poprvé setkala se skutečným Zlem... Které nemilosrdně vtrhlo do jejího velmi křehkého života, zničilo jejího milovaného otce, vzalo mě a hrozilo, že se pro sebe stane hororem... A já si nebyl jistý, jestli ona měla dost síly bojovat se vším sama pro případ, že by celá její rodina zemřela rukou Caraffy?...
Hodina, která nám byla přidělena, uběhla příliš rychle. Caraffa stál na prahu a usmíval se...
Svou milovanou dívku jsem si naposledy přitiskl na hruď s vědomím, že ji neuvidím hodně dlouho a možná ani nikdy... Anna odcházela do neznáma a já mohl jen doufat, že Caraffa opravdu chce učí pro své vlastní bláznivé účely a v tomto případě ji alespoň nějakou dobu nic neohrožuje. Zatím bude v Meteoře.
– Líbil se ti ten rozhovor, Madonno? “ zeptal se Caraffa předstíraně upřímně.
– Děkuji, Vaše Svatosti. Ano, samozřejmě. I když bych dceru nejraději vychovávala sama, jak je v normálním světě zvykem, a nedávala ji do rukou neznámým lidem, jen proto, že s ní máte nějaký plán. Na jednu rodinu je málo bolesti, nemyslíš?
- No, záleží na kterém, Isidoro! Karaffa se usmál. – Opět je tu „rodina“ a RODINA... A ta vaše bohužel patří do druhé kategorie... Jste příliš silní a cenní na to, abyste jen tak žili, aniž byste platili za své příležitosti. Pamatujte, má „velká čarodějko“, všechno v tomto životě má svou cenu a za všechno musíte zaplatit, ať se vám to líbí nebo ne... A bohužel budete muset zaplatit velmi draze. Ale nemluvme dnes o špatných věcech! Měli jste se báječně, že? Uvidíme se později, Madonno. Slibuji vám, že to bude velmi brzy.
Ztuhla jsem... Jak mi tato slova byla povědomá!.. Tato hořká pravda mě provázela v mém stále krátkém životě tak často, že jsem nemohl uvěřit, že je slyším od někoho jiného!.. Pravděpodobně to tak skutečně bylo. pravda, že každý musel platit, ale ne každý to dělal dobrovolně... A někdy byla tato platba příliš drahá...
Stella se mi překvapeně zahleděla do tváře a zjevně si všimla mého podivného zmatku. Ale hned jsem jí ukázal, že „všechno je v pořádku, všechno je v pořádku“ a Isidora, která se na chvíli odmlčela, pokračovala ve svém přerušeném vyprávění.
Caraffa odešel a vzal mé drahé dítě pryč. Svět kolem mě potemněl a moje zničené srdce se kapku po kapce pomalu plnilo černou beznadějnou melancholií. Budoucnost se zdála být hrozivá. Nebyla v něm žádná naděje, nebyla tam žádná obvyklá důvěra, že ať to teď bude jakkoli těžké, nakonec všechno nějak dopadne a určitě bude všechno v pořádku.
Blotování (doslova - blotování) je přenos fragmentů makromolekul (DNA, RNA nebo proteinu), oddělených gelovou elektroforézou, na pevný podklad - membránu. Při studiích lidského genomu se často používá metoda blotting vyvinutá společností Southern, při které se oligonukleotidová sonda v roztoku hybridizuje s DNA adsorbovanou na membráně (hybridizace Southern blot). Genomová DNA (obvykle izolovaná z leukocytů nebo fetálních buněk) je rozštěpena na krátké fragmenty, separována v agarózovém gelu, přenesena na membránu a následně jsou identifikovány specifické oblasti pomocí hybridizace s oligonukleotidovými sondami (obr. 65.6). Tato metoda identifikuje jedinečné fragmenty DNA, jejichž velikost je přibližně jedna miliontina genomu.
Význam metody pro medicínu je dán schopností studovat určitý fragment genomové DNA u každého člověka.
Metoda se používá k detekci velkých přestaveb v DNA a některých bodových mutací (většinu bodových mutací nelze touto metodou detekovat).
Denaturace DNA se provádí alkálií. Po dokončení elektroforézy je gel umístěn do zásaditého (alkalického) roztoku, ve kterém dvouvláknové fragmenty DNA ztrácejí své vazby a stávají se jednovláknovými.
Přenos DNA z gelu na nitrocelulózový nebo nylonový filtr se provádí v roztoku pufru. Filtr a stoh filtračního papíru se umístí přímo na povrch gelu. Vlivem kapilárního efektu vzniká kolmo k rovině gelu vyrovnávací proud. DNA vymytá z gelu je zadržena filtrem a téměř celá skončí na jeho povrchu. Po přenosu jsou jednovláknové nitě upevněny na filtru. Umístění fragmentů na filtru přesně odpovídá jejich umístění v gelu. 3. Pro vizuální identifikaci požadovaných fragmentů (DNA fixovaná na filtru není vidět) se provádí hybridizace se specifickou nukleotidovou sekvencí značenou radionuklidy nebo fluorescenční značkou, oligonukleotidovou syntetickou sondou (taková sonda se skládá z 16- 30 párů bází) nebo klonovaný fragment DNA. Nukleotidová sekvence sondy musí být plně nebo částečně komplementární k oblasti studované genomové DNA.
Když je filtr inkubován s roztokem obsahujícím značenou sondu, dojde k hybridizaci komplementárních řetězců DNA sondy a fragmentu na filtru. Nespecificky navázané molekuly sondy jsou vymyty pomocí speciálního postupu.
Radioaktivně označené oblasti se detekují vystavením filtru rentgenovému filmu (autoradiografie). Po vyvolání jsou na filmu viditelné pruhy DNA značené sondou.
Neradioaktivní značky jsou vizualizovány fluorescencí nebo nepřímo protilátkami.
Takže: Southern blot hybridizace je metoda pro analýzu struktury dané oblasti genomu, založená na:
2) separaci množství výsledných fragmentů pomocí elektroforézy na ploché plotně s agarózou nebo jiným gelem;
3) přenesení produktů separace na vrstvu porézního materiálu, například na nitrocelulózový filtr tak, že všechny fragmenty DNA jsou přeneseny na filtr a fixovány na něm, čímž se vytvoří otisk identický s rozložením fragmentů v gelu po oddělení;
4) hybridizace filtru s radioaktivně nebo barvivem značeným fragmentem DNA nebo RNA (sondou), který v sekvenci odpovídá analyzované oblasti genomu. Výsledkem je, že vzorek se díky komplementárním interakcím váže na ty části filtru, kde jsou umístěny studované fragmenty genomu, a poloha těchto fragmentů je identifikována podle polohy značky ze vzorku na filtru.
A jak bylo uvedeno výše, pomocí hybridizace Southern blot je možné určit identitu nebo rozdíl v délkách fragmentů (polymorfismus délky restrikčních fragmentů, RFLP) získaných restrikčním štěpením stejného lokusu v různých porovnávaných genomech.
Jakmile jsou DNA, RNA nebo proteiny odděleny, musí být přeneseny na pevný nosič pro detekci a další operace, které se v gelu obtížně provádějí. Proces převodu vedoucí k imobilizace molekul , tj. se nazývá pevný ve stacionárním stavu blotování (v angličtině. - blotování ). Jako substrát se používají nylonové nebo nitrocelulózové membrány.
Blotování(z anglického blotting - blotting) je metoda přenosu elektroforetických fragmentů DNA na speciální film (membránu) vyrobený z nitrocelulózy, která váže (imobilizuje) jednovláknové molekuly DNA.
Southern blotting(podle jména autora, který to navrhl) je založen na pohybu fragmentů DNA v důsledku kapilárního efektu. Proces přenosu fragmentů DNA obsažených v agarózovém gelu na nitrocelulózový film pomocí filtračního papíru je podobný blotování.
Analýza se provádí následovně:
– Izolovaná, purifikovaná, denaturovaná a fragmentovaná DNA se umístí na plát agarózového gelu, kde elektroforetická separace fragmenty podle hmotnosti a náboje.
– List agarózového gelu se umístí na filtrační papír navlhčený koncentrovaným fyziologickým roztokem (pufrem).
– Poté je na gel aplikován nitrocelulózový filtr, kde dochází k imobilizaci (resp. adsorpci, resp. fixaci) jednovláknových fragmentů DNA.
– Na filtr je umístěn stoh listů suchého filtračního papíru, který zajišťuje pomalý průtok tlumivého roztoku gelem (tj. slouží jako druh kapilárního čerpadla). Fyziologický roztok, procházející agarózovým gelem, s sebou nese fragmenty DNA, které jsou zadrženy a vázány nitrocelulózou, a roztok je absorbován suchým filtračním papírem.
– Dále je DNA denaturována alkálií a filtr je udržován ve vakuu při teplotě 80 0 C, v důsledku čehož jsou jednovláknové fragmenty DNA nevratně imobilizovány (fixovány) na nitrocelulóze. V tomto případě umístění imobilizovaných proužků DNA přesně odpovídá jejich umístění v gelu.
– DNA navázaná na filtr se umístí do roztoku se sondou značenou DNA, ve které dochází k hybridizaci. Pouze fragmenty DNA k ní komplementární budou hybridizovat (vytvářet vodíkové vazby) se specifickou sondou, kterou lze detekovat jako světlé pruhy na rentgenovém filmu, tzn. autorádiografie nitrocelulózového filtru
Dot blot. K přípravě dot blotů se přípravek DNA nebo RNA aplikuje přímo na filtr. Kapky drogy vypadají jako tečky na filtru, což vysvětluje název typu blottingu (anglicky: dot). 1) Z genomové DNA předem ošetřené ultrazvukem se vytvoří fragmenty dlouhé 5–10 nukleotidových párů.
2) Aby byly sondy DNA nebo RNA přístupné sondě, je potřeba je denaturovat, tzn. převést na jednořetězcovou formu. K tomu dochází vlivem teploty 100 °C.
3) Denaturované nukleové kyseliny se inkubují na ledu: rychlý pokles teploty zabrání jejich renaturaci, tzn. komplementární párování řetězců. Denaturovaná DNA nebo RNA se aplikuje přímo na filtr, který se inkubuje v roztoku obsahujícím sondu.
4) Aby se analyzovaná nukleová kyselina nedostala do roztoku, musí být fixována na filtru (membráně). K tomu se používají dva typy filtrů: nitrocelulózový a nylonový.
K imobilizaci nukleových kyselin na nitrocelulózovém filtru se používá smažení při 80 °C ve vakuu a na nylonovém filtru UV ozařování po dobu 3–5 minut.
5) Po inkubaci preparátu nukleové kyseliny izotopově značenou sondou se provádí autoradiografie ve speciální kazetě nebo identifikace pomocí neradioaktivních metod.
Dot blotting umožňuje odpovědět pouze na jednu otázku: zda je v daném vzorku přítomna požadovaná nukleotidová sekvence.
Analýza Northern blot platí:
1) k izolaci a analýze RNA (například k určení, zda je mRNA přečtená z daného genu přítomna v daném buněčném typu, tj. zda je gen exprimován nebo ne;
2) určit množství této RNA a její změny ve vývoji daného typu buňky;
3) k určení velikosti transkriptu genu.
V tomto případě jsou molekuly RNA izolované z buňky separovány podle velikosti pomocí gelové elektroforézy a poté přeneseny na filtr. Po hybridizaci se značenou jednovláknovou sondou se identifikují místa hybridizace (homologie) RNA a sondy.
Pokud není známa nukleotidová sekvence požadovaného genu (nebo mRNA), ale je znám protein, jehož syntézu řídí, pak je možné izolovat malé množství čistého proteinu a určit aminokyselinovou sekvenci některé z nich (pozn. stačí 5–6 aminokyselinových zbytků). Pomocí tabulky genetického kódu je možné stanovit všechny možné nukleotidové sekvence v úseku mRNA (nebo genu samotného), který kóduje danou aminokyselinovou sekvenci. V tomto případě může být syntetizována sonda pro hledání požadovaných klonů v genové knihovně.
Western blottinG(imunoelektroblotting, protein blotting) je metoda pro identifikaci unikátních proteinů. Je založen na fenoménu vysoce specifické interakce antigen-protilátka. Antigen (cíl) je tedy stanovovaný protein a sonda je protilátka proti němu.
Získají se protilátky proti studovanému proteinu různé způsoby. Nejjednodušší je vstříknout vzorek purifikovaného proteinu do krevního oběhu laboratorního zvířete (obvykle králíka). Jeho tělo produkuje protilátky (imunoglobuliny) proti tomuto cizímu proteinu. Jedná se o primární protilátky, které budou interagovat s cílovým proteinem.
Nebylo by však rozumné zavádět identifikační značku přímo do údajů o protilátce. Detekce různých proteinů by vyžadovala značení různých protilátek, což by vedlo k vysokým nákladům. Ukázalo se, že je rozumnější používat univerzální protilátky – konjugované antiimunoglobuliny, což jsou v podstatě protilátky proti protilátkám produkovaným použitím identifikovaného proteinu jako antigenu. Například anti-imunoglobuliny konjugované s králičím Ig budou interagovat se všemi imunoglobuliny syntetizovanými u králíků na různé antigeny. Jsou to tedy právě takové univerzální sekundární protilátky, které nesou izotopovou nebo neradioaktivní značku. Kromě neizotopové značky, která v průběhu řady reakcí vede ke vzniku nerozpustné barevné sloučeniny (jako v případě blottingu nukleové kyseliny), je velmi vhodná chemiluminiscenční značka, která má vyšší citlivost. často používaný.
1) Extrakce proteinů z homogenátu
2) Separace proteinů podle molekulové hmotnosti pomocí SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE). Metoda SDS elektroforézy zahrnuje denaturaci nativních proteinů. Molekuly proteinu se stejnou molekulovou hmotností tedy projdou stejnou dráhou v gelu a seřadí se ve formě proužku. Protože jsou ve směsi přítomny proteinové molekuly různých velikostí, tvoří se mnoho pásů. Výsledky elektroforézy lze vizualizovat proteinovým barvením (Coomassie brilantní modř, amidočerň, stříbrné barvení). Barvení stříbrem má jedinečnou citlivost, která umožňuje detekci pouhých 0,1 ng proteinu ve výsledném pásu. To je velmi důležité pro kontrolu množství proteinu aplikovaného na gel.
3) Přenos proteinů z gelu na membránu. Děje se tak proto, že polyakrylamid neumožňuje velkým molekulám imunoglobulinu difundovat do proteinu. A protein imobilizovaný na membráně se stává přístupným pro protilátky. Na rozdíl od blottingu nukleové kyseliny dochází k přenosu proteinu na membránu vlivem elektrických sil, tzn. v elektrickém poli.
4) Výsledný blot se inkubuje s antisérem k proteinu a poté s antiimunoglobuliny. Výsledek je vizualizován podle použitého typu štítku.
Omezení:
1) velká velikost studované fragmenty výrazně přesahující délku DNA sond a bránící přímé molekulární analýze;
2) nemožnost libovolného výběru konců studovaných sekvencí, daná přítomností odpovídajících restrikčních míst v původní molekule DNA;
3) potřeba velkého množství dobře vyčištěné vysokomolekulární genomové DNA (alespoň 10 μg na reakci, což odpovídá 0,5–1 ml krve),
4) pro genomovou hybridizaci - přítomnost radioaktivních sond DNA s vysokou specifickou aktivitou alespoň 109 pulzů/min * µg), pracujících po omezenou dobu, a speciálně vybavenou izotopovou jednotkou. Delší vystavení autogramů navíc výrazně prodlužuje dobu získání výsledků.
5) vysoká pracnost výzkum
Southern blot) je metoda používaná v molekulární biologii k identifikaci specifické sekvence DNA ve vzorku. Metoda Southern blotting kombinuje elektroforézu na agarózovém gelu pro frakcionaci DNA s technikami pro přenos délkově oddělené DNA na membránový filtr pro hybridizaci. Metoda je pojmenována po svém vynálezci, anglickém biologovi Edwinu Southernovi.Jiné přenosové (blotovací) technologie, jako je Western blot, Northern blot, Southern blotting, používají podobné metody, ale pro detekci RNA nebo proteinu ve vzorku, a jsou pojmenovány podle metody vynalezené Southernem. Vzhledem k tomu, že Southern blot je pojmenován po vědci, termín je psán velkým písmenem, zatímco Western blot a Northern blot jsou psány malým písmenem.
Metoda
- Restrikční endonukleázy štěpí vysokomolekulární DNA na menší fragmenty.
- Fragmenty DNA jsou podrobeny elektroforéze na agarózovém gelu pro separaci délky.
- V případě, že některé fragmenty DNA jsou delší než 15 kb, je gel před přenosem ošetřen např. kyselinou chlorovodíkovou, která způsobí depurinaci DNA a usnadní přenos na membránu.
- Při použití metody alkalického přenosu se agarózový gel umístí do alkalického roztoku, který denaturuje dvoušroubovici DNA a usnadní vazbu negativně nabité DNA na kladně nabitou membránu pro další hybridizaci. V tomto případě je zničena i zbývající RNA.
- Na horní nebo spodní stranu agarózového gelu se umístí vrstva nitrocelulózové (nebo nylonové) membrány. Tlak je aplikován přímo na gel nebo přes několik vrstev papíru. Pro úspěšný přenos je nutný těsný kontakt mezi gelem a membránou. Tlumič je transportován kapilárními silami z oblasti s vysokým obsahem vody do oblasti s nízkým obsahem vody (membrána). To zahrnuje přenos DNA z gelu na membránu. Polyaniontová DNA se váže na kladně nabitou membránu prostřednictvím iontoměničových interakcí.
- Pro konečnou fixaci DNA na membránu se tato zahřeje ve vakuu na teplotu 80 °C po dobu dvou hodin nebo se osvětlí ultrafialovým zářením (v případě nylonových membrán).
- Hybridizace radioaktivně (fluorescenčně) značeného vzorku se známou sekvencí DNA se provádí pomocí membrány.
- Po hybridizaci se přebytečný vzorek smyje z membrány a produkty hybridizace se vizualizují autorádiografií (v případě radioaktivního vzorku) nebo se posoudí barva membrány (v případě chromogenního barvení).
Výsledek
Hybridizace vzorku se specifickou oblastí DNA fixovanou k membráně indikuje přítomnost analyzované nukleotidové sekvence ve vzorku.
aplikace
Ke stanovení lze použít Southern blotting, který se provádí s genomovou DNA ošetřenou restrikčními endonukleázami čísla kopií genů v genomu. Sonda, která hybridizuje pouze s jediným fragmentem DNA, který nebyl štěpen restrikčními enzymy, bude produkovat jeden pruh na Southern blotu, zatímco více pruhů na blotu ukazuje, že sonda hybridizovala s více identickými sekvencemi. Změny hybridizačních podmínek (zvýšení teploty, při které se hybridizace provádí, změna koncentrace soli) vedou ke zvýšení specificity a snížení hybridizace s blízkými, ale ne identickými sekvencemi.
Poznámky
viz také
- Blotování
- Northern blotting
Nadace Wikimedia. 2010.
Podívejte se, co je „Southern blotting“ v jiných slovnících:
Southern blotting- Southern blotting Metoda detekce specifických nukleotidových sekvencí přenosem elektrofreticky separovaných fragmentů DNA z agarózového gelu na nitrocelulózový (papírový) filtr díky kapilárnímu efektu... ...
Southern blotting- - Biotechnologická témata EN Southern blotting ... Technická příručka překladatele
Southern blotting- Southern blotting Southern blotting vzorku DNA. Southern blotting zahrnuje elektroforetickou separaci DNA a způsoby přenosu fragmentů DNA z agarózového gelu na membránu pod vlivem elektrického pole pro další analýzu pomocí... ... Výkladový anglicko-ruský slovník o nanotechnologiích. - M.
Southern blotting, Southern transfer Southern blotting, Southern blotting. Způsob detekce specifických nukleotidových sekvencí přenosem elektrofreticky oddělených fragmentů DNA z agarózového gelu na nitrocelulózu... ... Molekulární biologie a genetika. Slovník.
SOUTHERN BLOTTING- (Southern blot analysis) metoda identifikace konkrétní formy DNA v buňkách. Molekuly DNA jsou z buněk odstraněny a pomocí restrikčních enzymů rozděleny na malé fragmenty. Tyto fragmenty jsou od sebe odděleny a pomocí genu... ... Výkladový slovník medicíny
Southern blot C blot hybridizace- Southern blot, blot hybridizace podle S. * Southern blot, blot hybridizace podle S. * Southern blot nebo S. hybridizace nebo S. transfer gel blotting technika (viz), při které jsou fragmenty DNA separovány podle velikosti v agarózovém gelu ... ...
Způsob identifikace specifických forem DNA v buňkách. Molekuly DNA jsou z buněk odstraněny a pomocí restrikčních enzymů rozděleny na malé fragmenty. Tyto fragmenty jsou od sebe odděleny a je provedeno hledání pomocí genové sondy... ... Lékařské termíny
Southern blotting Southern blotting je metoda používaná v molekulární biologii k detekci specifické sekvence DNA ve vzorku. Metoda Southern blotting kombinuje elektroforézu na agarózovém gelu s... ... Wikipedií
- (z anglického Blot) obecný název pro metody molekulární biologie pro přenos určitých proteinů nebo nukleových kyselin z roztoku obsahujícího mnoho dalších molekul na libovolný nosič (nitrocelulózová membrána, PVDF nebo ... ... Wikipedia
blotting transfer blotting- blotování, blotovací přenos * blotování, blotovací přenos * blotování nebo blotový přenos postup pro přenos elektroforeticky separované DNA (viz), fragmentů DNA, RNA, fragmentů RNA nebo proteinů z gelu (agaróza nebo polyakrylamid) do ... ... Genetika. encyklopedický slovník
Jiné přenosové (blotovací) technologie, jako je Western blot, Northern blot, Southern blotting, používají podobné metody, ale pro detekci RNA nebo proteinu ve vzorku, a jsou pojmenovány podle metody vynalezené Southernem. Vzhledem k tomu, že Southern blot je pojmenován po vědci, termín je psán velkým písmenem, zatímco Western blot a Northern blot jsou psány malým písmenem.
Encyklopedický YouTube
1 / 1
Southern blotting
titulky
Metoda
- Restrikční endonukleázy pro štěpení DNA s vysokou molekulovou hmotností na menší fragmenty.
- Fragmenty DNA jsou podrobeny elektroforéze na agarózovém gelu pro separaci délky.
- Pokud jsou některé fragmenty DNA delší než 15 kb, je gel před přenosem ošetřen např. kyselinou chlorovodíkovou, která způsobí depurinaci DNA a usnadní přenos na membránu.
- Při použití metody alkalického přenosu se agarózový gel umístí do alkalického roztoku, který denaturuje dvoušroubovici DNA a usnadní vazbu negativně nabité DNA na kladně nabitou membránu pro další hybridizaci. V tomto případě je zničena i zbývající RNA.
- Na horní nebo spodní stranu agarózového gelu se umístí vrstva nitrocelulózové (nebo nylonové) membrány. Tlak je aplikován přímo na gel nebo přes několik vrstev papíru. Pro úspěšný přenos je nutný těsný kontakt mezi gelem a membránou. Tlumič je transportován kapilárními silami z oblasti s vysokým obsahem vody do oblasti s nízkým obsahem vody (membrána). To zahrnuje přenos DNA z gelu na membránu. Polyaniontová DNA se váže na kladně nabitou membránu prostřednictvím iontoměničových interakcí.
- Pro konečnou fixaci DNA na membránu se tato zahřeje ve vakuu na teplotu 80 °C po dobu dvou hodin nebo se osvětlí ultrafialovým zářením (v případě nylonových membrán).
- Hybridizace radioaktivně (fluorescenčně) značeného vzorku se známou sekvencí DNA se provádí pomocí membrány.
- Po hybridizaci se přebytečný vzorek z membrány smyje a produkty hybridizace se vizualizují autoradiografií (v případě radioaktivního vzorku) nebo se posoudí barva membrány (v případě chromogenního barvení).
Výsledek
Hybridizace vzorku se specifickou oblastí DNA fixovanou k membráně indikuje přítomnost analyzované nukleotidové sekvence ve vzorku.
aplikace
Ke stanovení lze použít Southern blotting, který se provádí s genomovou DNA ošetřenou restrikčními endonukleázami čísla kopií genů v genomu. Sonda, která hybridizuje pouze s jediným fragmentem DNA, který nebyl štěpen restrikčními enzymy, bude produkovat jeden pruh na Southern blotu, zatímco více pruhů na blotu ukazuje, že sonda hybridizovala s více identickými sekvencemi. Změny hybridizačních podmínek (zvýšení teploty, při které se hybridizace provádí, změna koncentrace soli) vedou ke zvýšení specificity a snížení hybridizace s blízkými, ale ne identickými sekvencemi.
